Nature Chemistry：揭示多功能三和酶LepI的催化分子机制

在有机制备中亦会，不动点亚胺能够同时框架多个磷-磷/磷-俱原子键，并且常常带有极高的周边抑制和立体抑制。但在大自然界中亦会，中三醇不动点亚胺的蛋白质却只有少数被报道过。分支乙烯变位蛋白质（chorismate mutase）、precorrin-8x中三基变位蛋白质、SpnF和PyrI4等不动点蛋白质的构造表明大自然进化出了多种可以中三醇[4+2]末口烯烃及其他不动点亚胺的蛋白折叠异构体，并且这些构造可以抑制不动点亚胺的周边抑制和立体抑制。2017年，UCLA的汉慈禧太后教授课题组报道了一种S-腺苷肉乙烯（SAM）倚赖的多动态不动点蛋白质LepI，它既能中三醇俱Diels-Alder（HDA）亚胺，又能中三醇当此Claisen聚合反应亚胺6。在无法LepI共存下，氟化2可以自发性硫乙烯成型(E)-3和(Z)-4，并大幅度自发性再次发生分子内Diels-Alder亚胺（IMDA）或HDA亚胺分解一系列的末口烯烃转化。而在LepI的中三醇下，2必需专一性地硫乙烯成型(E)-3，并大幅度再次发生HDA亚胺成型一般而言转化10，即Leporin C。LepI同属O-中三基重新分配蛋白质远亲，但是它无法中三基重新分配蛋白质能活性。为什么该蛋白质可以立体抑制地中三醇硫乙烯亚胺、HDA亚胺和当此Claisen聚合反应亚胺？SAM的效用又是什么？为了回答这些原因，2019年7月21日，中亦会国科学院苏州有机化学研究小组的周佳海课题组和UCLA的汉慈禧太后课题组合作在Nature Chemistry俱志上发表文章Structural Basis for Stereoselective Dehydration and Hydrogen-Bonding Catalysis by the SAM-Dependent Pericyclase LepI，重构了高分辨率的LepI及其与氟化1、8、10的亚基晶体构造，并通过与UCLA的Kendall Houk课题组合作进行理论算出社亦会能活动，系统地阐释了LepI中三醇的分子抑制。在这些亚基构造中亦会，氟化1是作为硫乙烯亚胺的亚胺甘氨乙烯来与LepI顺利完成钐测试，目标是解读立体抑制硫乙烯亚胺机理；氟化10是HDA亚胺和当此Claisen聚合反应亚胺的转化，其与LepI的亚基晶体构造可以用来相当亚胺前后的异构体确实激发彻底改变；exo转化8作为endo转化9的甘氨乙烯，其与LepI的亚基构造可用于解读当此Claisen聚合反应亚胺的机理。LepI蛋白的有机体构造通过锌原子的单波长反常散射法则被重构。在该构造中亦会，两分子的LepI以N口糖蛋白互不缠绕交叉在一起，而C口糖蛋白则是带有O-中三基重新分配蛋白质远亲众所周知的Rossman折叠这种超二级构造，且每分子的LepI为基石一分子辅蛋白质SAM。特异性蛋白质能活精确测量测试推测了H133、R295和D296对中三醇能活性的极其重要效用，为基石LepI-SAM-1、LepI-SAM-8、LepI-SAM-10亚基构造以及对自由基亚基构造的算出，该文提出LepI的中三醇抑制很不太可能如下：1. 硫乙烯机理不太可能为E1-cb简而言之：极其重要残基H133作为乙烯，去亚胺苯上的4-OH，并且平稳相应的烯醇，而斜向支链上的羟基以格氏试剂共对称的方向离去，R295以及附近的共价键在线辩解有加强效用。离去的氢键(W')不太可能因故被这些残渣吞噬，并与磷酰胺保持共价键。LepI的硫乙烯效用是通过将乙烯和乙烯内置在格氏试剂结构上和将线型的醇亚胺2通常在相应的格氏试剂异构体中亦会来实现1，4-格氏试剂消除的。2. 在HDA亚胺中亦会，由于苯末口上有多余的空间，所以斜向支链肟可自发性轴向到利于亚胺再次发生的右边。盘子周围的疏水效用和大湖效用是非对映抑制实现的极其重要。更为却是为重要的是，H133和R295可以作为共价键给体，关键作用了平稳自由基的效用，降低了反映能垒。3. 在之前的报道中亦会，SAM中亦会的负电荷对蛋白质能活颇为却是为重要，这显然了SAM不太可能带有静电中三醇的效用。静电中三醇是不太可能被辨认出的一种中三醇方式。LepI的能活性盘子是疏水的，重硫更高，少数的重硫残基可激发一个合理的电场，使亚胺物处于适宜亚胺再次发生的取向，平稳自由基，降低能垒，加强亚胺的再次发生。虽然晶体构造中亦会SAM与亚胺并无法直接接触，但是SAM上的负电荷亦会冲击能活性盘子的电场，可以推测SAM可以平稳比亚胺物带有更为高偶却是矩的自由基。4. 对于当此Claisen聚合反应亚胺，氟化9已经处于接近NAC（near-attack conformation）的异构体。将H133突变为Q或N，该亚胺能活性大大下滑，这说明H133却是有不太可能是亚胺的。为基石算出，推测LepI通过H133和R295的亚胺和静电效用，能诱导了当此Claisen聚合反应的亚胺，平稳了自由基，从而中三醇了该亚胺。LepI-SAM-1、LepI-SAM-8和LepI-SAM-10亚基晶体构造中亦会的能活性盘子。LepI-SAM-1亚基构造中亦会，苯上的羟基与H133有共价键效用，六元末口上的硫原子和斜向支链上的羰基与R295、D296等残基及盘子中亦会的氢键成型了一个共价键在线。比如说的是，构造中亦会的肟斜向支链并无法往末口方向紧邻，成型易于再次发生DA亚胺的异构体，而是溶剂中亦会的占据了末口顶部的右边。对比三个亚基晶体构造可以看出，二者苯及苯末口的为基石右边相同，共价键在线也大略类似，但R295的异构体再次发生了较大的彻底改变。在O-中三基重新分配蛋白质类远亲中亦会，共存着His-Glu中三醇二联体。而在LepI中亦会，His-Glu中亦会的His被Arg（R295）取代了。相比His，Arg是更为好的共价键给体，静电平稳效用也更为佳；且Arg乙烯性更为弱，更为容易停留在亚胺的情况下。这很不太可能就是LepI能中三醇不动点亚胺而不是中三基重新分配亚胺的极其重要。该社亦会能活动不仅扩充了我们对O-中三基重新分配蛋白质类远亲的动态认知，也让我们对SAM的效用有了在此之后认识，同时也伴随着SAM及倚赖SAM的蛋白质在生命体循环系统中亦会还有更为多在此之后效用和动态等着科学研究去辨认出和探索。相比有机制备中亦会的中三醇剂，制备蛋白质中亦会的蛋白质常常带有更为高的立体专一性和中三醇效率。鉴于不动点亚胺在制备领域中亦会的却是为重要性，对新型不动点蛋白质的辨认出和探索在下一代制备蛋白质以及有机制备法则中亦会校上有巨大的潜力。周佳海课题组的高级工程师蔡毓娟、汉慈禧太后课题组的研究员Yang Hai和Masao Ohashi并列论文第一作者。晶体偏振光数据分别在苏州光源BL17U1、BL18U1和BL19U1线站利用的。专家点评戈惠明（华东师范大学生命科学学院教授，国家政府优秀人才Fund获得者）不动点亚胺是一类在亚胺反复中亦会可成型末口状自由基的亚胺，在有机制备中亦会带有却是为重要的应用。在生命体体中亦会，不太可能也辨认出了一系列不动点亚胺蛋白质，如Claisen聚合反应亚胺蛋白质，Cope聚合反应亚胺蛋白质以及Diels-Alder亚胺的蛋白质等，其中亦会以Diels-Alder亚胺蛋白质被辨认出的大多，研究相对明晰。在2017年，UCLA的汉慈禧太后课题组在对由来曲霉菌的Leporin C顺利完成制备蛋白质研究时辨认出，LepI尽管被注释为一个SAM倚赖的中三基重新分配蛋白质，然而却辨认出可以同时中三醇硫乙烯亚胺、Diels-Alder、俱Diels-Alder以及当此Claisen聚合反应等亚胺，是一鲜见的多动态不动点亚胺蛋白质。那么，动态如此多样的LepI是如何发挥中三醇效用的，SAM在中三醇反复中亦会发挥了什么效用，能活性之间是如何协调各步亚胺的关系的？这些原因均尚未有解答。近日，中亦会国科学院苏州有机化学研究小组的周佳海课题组和UCLA的汉慈禧太后课题组合作探究了LepI中三醇的分子抑制。他们通过重构硫乙烯亚胺的亚胺甘氨乙烯氟化1与LepI的钐构造，解读了LepI立体抑制硫乙烯的亚胺机理。同时，辨认出LepI在中三醇HDA的亚胺中亦会，由于苯上的斜向支链肟自发性轴向到有利于亚胺再次发生的右边，H133和R295通过成型共价键平稳了自由基，降低了亚胺能垒使得亚胺得以顺利完成。通过对LepI-SAM-1的亚基晶体构造顺利完成重构，辨认出SAM在亚胺中亦会并无法与亚胺再次发生直接的效用而是成型一个共价键在线，通过静电中三醇来与此相反。通过重构氟化8与LepI的钐构造同时为基石化学算出，未确定LepI通过H133和R295的亚胺和静电效用，能诱导了当此Claisen聚合反应的亚胺，平稳了自由基，从而中三醇了该亚胺。通过对极其重要中三醇能活性的点突变，推测推测的抑制是合理的。最后作者通过将LepI与O-中三基重新分配蛋白质类远亲中亦会的其它蛋白质顺利完成相当辨认出，原来的中三醇二联体His-Glu在LepI中亦会进化成为Arg-Glu，这一彻底改变使得LepI进化为一个多动态的不动点亚胺蛋白质。不动点亚胺蛋白质由于高度的立体专一性和高效的配位方式在天然转化制备蛋白质中亦会有却是为重要的效用。而LepI作为目前被报道的非常鲜见的多动态不动点亚胺蛋白质，对其中三醇抑制的清晰阐述为今后大幅度改造和利用发扬光大了基石。比如说典故：Yujuan Cai, Yang Hai, Masao Ohashi, Cooper S. Jamieson,et al.Structural basis for stereoselective dehydration and hydrogen-bonding catalysis by the SAM-dependent pericyclase LepI ,Nature Chemistry (2019) ,Published: 22 July 2019