献给初学者：常用的细胞凋亡扫描方法

在实验中都经常需要样品肽的不可逆转状况，这里总结了几种常见的不可逆转样品方律有，希望能够帮到你。

一肽不可逆转的脊椎动物样品

引发不可逆转的肽在形态上有一定的特点。

光学光学仪器和倒置光学仪器

未着色肽：不可逆转肽的微积变长、变形，肽表皮明晰但留意到发泡现像，肽不可逆转中都晚期可见不可逆转小微。贴壁肽留意到皱缩、变圆、脱落。

着色肽：常用姬姆萨着色、瑞氏着色等。不可逆转肽的着色质果汁、忽视，核糖体甘油、着色质分割成条柱状和不可逆转小微等众所周知的不可逆转形态。

导弹光谱光学仪器和共看做激光扫描光学仪器

一般以肽核反应着色质的脊椎动物彻底改变为指亦同来标新立异肽不可逆转的进展状况。

常用的 DNA 依赖性树脂有：HO 33342（Hoechst 33342），HO 33258（Hoechst 33258），DAPI。三种树脂与 DNA 的联结都都是嵌入式的，主要联结在 DNA 的 A-T 碱基区。紫除此以外光促使时导弹明亮的蓝色导弹光谱。

Hoechst 是与 DNA 特异联结的活性树脂，储存盐酸用热水混和 1 mg/ml 的ppm，使用时用 PBS 氢氧化钠，终因ppm为 10 μg/ml。

DAPI 为半通透性，使用值得注意一般而言肽的着色。储存盐酸用热水混和 1 mg/ml 的ppm，使用终因ppm一般为 10 μg/ml。

结果标新立异

肽不可逆转全过程中都肽核反应着色质的脊椎动物彻底改变分为三期：Ⅰ 期的肽核反应呈波纹柱状（rippled）或呈折缝样（creased），其余部分着色质留意到果汁状况下；Ⅱa 期肽核反应的着色质持续性看做、忽视；Ⅱb 期的肽核反应甘油为劈开，导致不可逆转小微（上图 1）。

入射光电子光学仪器检视

结果标新立异

不可逆转肽微积变长，肽质果汁。不可逆转Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的肽核反应内着色质持续性缠绕，留意到许多称为气穴现像（citations）的空泡结构；Ⅱa 期肽核反应的着色质持续性看做、忽视；肽不可逆转的中都晚期，肽核反应甘油为劈开，导致不可逆转小微（上图 2）。

二Annexin V 律

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）一点点位于肽表皮的内侧，但在肽不可逆转的一时期，PS 可从肽表皮的内侧翻转到肽表皮的表面，暴露在肽除此以外环境中都（上图 3）。Annexin-V 是一种大分子量为 35～36 KD 的 Ca2+ 依赖性磷脂联结肽，能与 PS 极低亲和力依赖性联结。将 Annexin-V 进行时导弹光谱素（FITC、PE）或 biotin 亦同记，以亦同记了的 Annexin-V 作为导弹光谱磁性，利用流式肽仪或导弹光谱光学仪器可样品肽不可逆转的引发。

铋丙啶（propidine iodide, PI）是一种碱基树脂，它没律透过明晰的肽表皮，但在不可逆转中都中都晚期的肽和死肽，PI 能够透过肽表皮而使肽核反应红染。因此将 Annexin-V 与 PI 转换使用，就可以将不可逆转早中都晚期的肽以及死肽区分或多或少。

方律有

微粒肽的着色：将一点点培育和诱导不可逆转的微粒肽（0.5～1×106）用 PBS 彩衣 2 次，自组 100 μl Binding Buffer 和 FITC 亦同记的 Annexin-V（20 μg/ml）10 μl，固体避光 30 min，再自组 PI（50 μg/ml）5 μl，避光自由基 5 min 后，自组 400 μl Binding Buffer，立即用 FACScan 进行时流式肽术定量样品（一般不将近 1 h）， 同时以不另加 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作为比如说相符合。

贴壁培育的肽着色：先用 0.25% 的胰酵素消化，冲彩衣、着色和研究同微粒肽。

攀片肽着色：同上，再一用导弹光谱光学仪器和共看做激光扫描光学仪器进行时检视。

结果

留意事项

1. 整个操作姿势要但会轻柔，切勿用力吹打肽。

2. 操作时留意避光，自由基完毕后即刻在一小时内样品。

三肝表皮下式的样品

肝细十面体在肽不可逆转的全过程中都起着交通枢纽依赖性，多种肽不可逆转诱因因子均可诱导多种不同的肽引发不可逆转，而肝细十面体包涵表皮电位（Δψm）的下降，被认为是肽不可逆转激活自由基全过程中都最早引发的事件，它引发在肽核反应不可逆转特点（着色质果汁、DNA 塌陷）留意到之前，一旦肝细十面体包涵表皮电位崩溃，则肽不可逆转不可逆转。

肝细十面体包涵表皮电位的存在，使一些亲脂性阳离子导弹光谱树脂如 Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide（DiOC6）、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide（JC-1）、Tetramethyl rhodamine methyl ester（TMRM）等可联结到肝细十面体基质，其导弹光谱的增强或增强说明肝细十面体内表皮电负性的增极低或下降。

方律有

将一点点培育的肽和诱导不可逆转的肽自组使用终因ppm为 Rhodamine 123（1 mM）或终因ppm为 DiOC6（25 nM），JC-1（1 mM），TMRM（100 nM），37 °C 平衡 30 min，流式肽计样品肽的导弹光谱风力。

留意事项

1. 即便如此因保持平衡染盐酸中都 pH 值的理论上，因为 pH 值的发生变化将影响表皮电位。

2. 与树脂降到平衡的肽悬盐酸中都如果则有有肽，他们将与其余部分树脂联结，下降树脂的ppm，激起假去极化。

四DNA 录像化样品

肽不可逆转时主要的再生特点是其着色质引发果汁，着色质 DNA 在核反应小微单位错综复杂的末端塌陷，导致 50～300 kbp 长的 DNA 大录像，或 180～200 bp 整数倍的寡核反应苷酸录像，在电子衍射上乏善可陈为梯形电泳上图谱（DNA ladder）。

肽经处置后，采用值得注意方律有复合极低纯度 DNA，进行时琼脂糖电子衍射和溴化乙啶着色，在不可逆转肽群中都可检视到众所周知的 DNA ladder。如果肽量常常，还可在复合极低纯度 DNA 后，用 32P-ATP 和碱基核反应苷酸前端核糖（TdT）亦同记 DNA，然后进行时电泳和捡射自显影，检视不可逆转肽中都 DNA ladder 的导致。

大大分子着色微 DNA 录像的推算出

肽不可逆转的一时期，着色微塌陷视为 50～300 kbp 长的 DNA 大录像。所有将近一定大分子量尺寸的碱基 DNA 大分子在琼脂糖液体中都的迁往速度相异。线性 DNA 的遗传生物体表面积将近液体表面积时，即降到分辨力的极限。此时液体便按大分子量的尺寸来筛分 DNA，DNA 像通过若夫特涅韦一样，以其上端指向线圈一极而通过液体，这种迁往模式称之为「攀」。因此，肽不可逆转一时期导致的 50～300 kbp 长的 DNA 大录像没律用普通的琼脂糖电子衍射来复合。

通常采用脉冲电泳新科技可圆满地解决这一问题。这个方律有是在液体上除此以外另加正交的交变脉冲线圈。每当线圈方向彻底改变后，大的 DNA 大分子便滞留在攀管中都，才于新的线圈轴向重新定向后，才能继续向左移动。DNA 大分子量越大，这种重排所需要的时间就越长。当 DNA 大分子变换方向的时间低于极低频率周期时，DNA 就可以按其大分子量尺寸分开。

DNA Ladder 推算出

方律有

取得成功肽（1×107）沉淀→肽甘油盐酸→13 000 rpm ×5 min→收集上清康熙，另加 1% SDS 和 RnaseA（5 mg/ml）56 °C，圈养 2 h→肽酵素 K（2.5 mg/ml）37 °C，2 h→1/10 微积 3 mol/l 醋酸钠和 2.5 倍微积的冷无水硫酸沉淀 DNA，4 °C 投宿→14 000 rpm×15 min→再一将沉淀熔化在 TE buffer 中都，另加 DNA Loading Buffer→1.2% 琼脂糖电子衍射，EB 着色并照相。

结果

不可逆转肽 DNA 则有量的流式肽计研究

方律有

收集肽→70% 冷硫酸（PBS 氢氧化钠）4 °C 一般而言投宿→PBS 冲彩衣，1 000 rpm × 10 min→RNase A（0.5 mg/ml）37 °C 消化 30 min→PI（50 mg/ml）着色，固体避光 15 min→FACScan 研究 DNA 亚二倍微的导致及肽周期的发生变化。

结果

ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay

优点：敏感度极低，适合于样品少量样本，小其余部分不可逆转肽。如临床活秘密组织样品。

五TUNEL 律

肽不可逆转中都，着色微 DNA 碱基塌陷或单链塌陷而导致大量的粘性 3'-OH 前端，可在碱基核反应苷酸前端核糖（TdT）的依赖性下，将碱基核反应苷酸和导弹光谱素、过氧化物酵素、碱性磷酸酵素或NAD导致的衍生物亦同记到 DNA 的 3'-前端，从而可进行时不可逆转肽的样品，这类方律有称为碱基核反应苷酸前端核糖激活的缺口前端亦同记律（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。

由于一点点的或正在增殖的肽几乎不会 DNA 的塌陷，因而不会 3'-OH 导致，常常能够被着色。TUNEL 实际上是大分子生物学与脊椎动物相联结的研究者方律有，对明晰的单个不可逆转肽核反应或不可逆转小微进行时原位着色，能精准地自由基肽不可逆转众所周知的生物化学和形态特点，可使用石蜡包埋秘密组织切片、冰冻秘密组织切片、培育的肽和从秘密组织中都复合的肽的肽形态推算出，并可样品出都只的不可逆转肽，因而在肽不可逆转的研究者中都被广泛采用。

六Caspase-3 活性的样品

Caspase 家族在激活肽不可逆转的全过程中都起着非常重要的依赖性，其中都 Caspase-3 为极其重要的指派大分子，它在不可逆转信号传递信息的许多途径中都充分发挥功能。Caspase-3 一点点以酵素原（32 KD）的形式存在于溶酶体中都，在不可逆转的一时期阶段，它被激活，再造的 Caspase-3 由两个大亚基（17 KD）和两个小亚基（12 KD）分成，甘油相应的溶酶体十面体核反应羧酸，最终因导致肽不可逆转。但在肽不可逆转的中都晚期和死亡肽，Caspase-3 的活性微小下降。

Western blot

研究 Procaspase-3 的再造，以及再造的 Caspase-3 及对羧酸多聚（ADP-核反应糖）聚合酵素（PARP）等的甘油。

方律有

收集肽→PBS 冲彩衣→抽提肽甘油盐酸→肽定量→SDS-PAGE 电泳→纤维素表皮或 PVDF 表皮移到→5% 脱脂封闭，固体 1.5～2 h 或 4 °C 投宿→Caspase-3 多抗或单抗固体自由基 1～2 h 或 4 °C 投宿→TBS-T（则有 0.05% Tween 20 的 TBS）彩衣 3 次，5～10 min/次→HRP-亦同记的驴抗鼠 IgG 或 AP 亦同记的驴抗鼠 IgG 固体自由基 1～2 h→ TBS-T 彩衣 3 次， 5～10 min/次→ECL 显影或 NBT/BCIP 显色。

结果

导弹光谱光谱学光谱仪研究

再造的 Caspase-3 能够特异切割 D1E2V3D4-X 羧酸，歧化 D4-X 聚合。根据这一特点，所设计出导弹光谱生物体酪氨酸的短肽 Ac-DEVD-AMC。在共价酪氨酸时，AMC 没律被促使导弹光谱，短肽被歧化后散发出 AMC，自由的 AMC 才能被促使导弹导弹光谱。根据释捡的 AMC 导弹光谱风力的尺寸，可以推算出 Caspase-3 的活性，从而反映 Caspase-3 被再造的素质。

方律有

取得成功肽一点点或不可逆转肽→PBS 冲彩衣→制备肽甘油盐酸→另加 Ac-DEVD-AMC（caspase-3 导弹光谱羧酸）→37 °C 自由基 1 h→导弹光谱光谱学光谱仪（Polarstar）研究导弹光谱风力（促使光波长 380 nm，导弹光波长为 430～460 nm）。

结果

流式肽术研究

方律有

取得成功肽一点点或不可逆转肽→PBS 冲彩衣→另加 Ac-DEVD-AMC→37 °C 自由基 1 h→UV 流式肽计研究 Caspase-3 阳性肽数和平均导弹光谱风力。

结果

七TFAR19 肽隐含和肽看做研究

TFAR19（PDCD5）是由本研究者室在国际上首先报导的一个拥有自己专利权的生命体新基因，中都后期的功能研究者表明，它是促进肽不可逆转的增强剂。利用导弹光谱素（FITC）亦同记的 TFAR19 单克隆免疫球肽为磁性，对肽不可逆转全过程中都 TFAR19 肽的隐含精准度及看做研究者留意到，不可逆转一时期 TFAR19 隐含精准度增极低并留意到快速核反应七度现像，伴随着肽核反应脊椎动物的发生变化，持续间歇性，在不可逆转小微中都仍然可见。

同时我们留意到，不可逆转一时期 TFAR19 肽的核反应七度早于磷脂酰丝氨酸（PS）除此以心形和肽核反应 DNA 的录像化，提示 TFAR19 肽的核反应七度是肽不可逆转非常一时期引发的事件之一。进一步的研究者证明，不可逆转一时期 TFAR19 的核反应七度具有普遍意义，多种不同肽不可逆转一时期均留意到 TFAR19 极低隐含和核反应七度。这为研究者肽不可逆转一时期所引发的事件，共享了一种新的新科技和指亦同。

TFAR19 肽的肽看做研究

材料路易斯酸

FITC 亦同记的单克隆免疫球肽，pH 7.4 、0.15 mol/L PBS，3% 的多聚甲醛，PBS-T（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 则有 0.2% Tween 20），胎牛滴胰岛素康熙，导弹光谱肽彩衣盐酸（pH 7.4 、0.15 mol/L PBS 则有 2% 胎牛滴胰岛素康熙及 0.1% NaN3），FACS 管，Tip 头，移盐酸器。

仪器

极低温精准度离心机，37 °C 水浴箱，导弹光谱光学仪器，共看做激光扫描光学仪器，流式肽仪。

方律有

1. 微粒肽的着色

（1）取得成功一点点和诱导不可逆转的肽（0.5～1×106），PBS 彩衣 2 次，1 000 rpm×10 min。

（2）3% 多聚甲醛冰浴 10 min，PBS 彩衣 2 次，1 000 rpm×10 min。

（3）自组 PBS-T 溶盐酸，37 °C 圈养 15 min，PBS 彩衣 2 次，1 000 rpm×10 min。

（4）自组 200 ml 胎牛滴胰岛素康熙，固体自由基 30 min。

（5）自组 5 ml FITC 亦同记的 TFAR19 单抗（终因ppm为 1:40），4 °C 自由基 30 min。

（6）导弹光谱肽彩衣盐酸彩衣 2 次，1 000 rpm×10 min。

将肽沉淀滴片，导弹光谱光学仪器及共看做激光光学仪器下检视 TFAR19 在肽中都的看做。同时用流式肽仪定量样品 TFAR19 肽的平均导弹光谱风力。

2. 贴壁肽的原位着色

（1）贴壁潮湿的对数期肽铺在 24 小孔或 6 小孔板中都（内有彩衣涤盖玻片），让其攀片潮湿，待长到 50%～80 % 满时，不可逆转诱导剂处置肽。

（2）将多种不同时间点处置的肽进行时免疫导弹光谱着色，着色步骤同上。

（3）将着色的攀片肽捡于一张滴有少量（5 ml）的载玻片上，导弹光谱光学仪器或共看做激光扫描光学仪器检视 TFAR19 在肽中都的看做。

3. 临床病理切片的着色、样品

4. 原代肽的培育、样品

5. 研究 TFAR19 肽在人微内各秘密组织器官的产自及看做

TFAR19 肽的隐含与临床营养不良

ELISA 律样品一点点人和营养不良状况下下，以及营养不良的多种不同时期，滴胰岛素康熙中都 TFAR19 肽精准度及其 TFAR19 自身免疫球肽精准度。

材料和路易斯酸

1. 一个大 Buffer：pH 9.6， 0.05 mol/L 碳酸盐 Buffer

2. 冲彩衣盐酸： pH 7.4，0.15 mol/L PBS 则有 0.05% Tween 20

3. 封闭盐酸： 3% BSA（用冲彩衣盐酸配制）

4. 酵素亦同免疫球肽的氢氧化钠：用封闭盐酸氢氧化钠

5. OPD 羧酸 Buffer：Na2 HPO4·12 H2O 1.84 g，柠檬酸 0.51 g，DDW 100 ml

6. 显色盐酸（现配现用）：羧酸 Buffer 10 ml，OPD 2 mg，30% H2O2 2 ml

7. 取消盐酸 2 mol/L H2SO4

8. 重组人 TFAR19，HRP 亦同记的驴抗人 IgG9 ELISA 板，Tip，移盐酸器，ELISA Reader（OD 490 nm），彩衣上弹

操作步骤

1. 用一个大 Buffer 氢氧化钠的重组人 TFAR19（1 mg/ml）一个大 ELISA 板，100 ml/well，37 °C 圈养 2 h 或 4 °C 投宿（一般 24 h 以上）。

2. 冲彩衣 Buffer 彩衣板三次，自组封闭盐酸，200 ml/well ， 37 °C 圈养 2 h 或 4 °C 投宿。

3. 冲彩衣 Buffer 彩衣板三次，自组多种不同氢氧化钠度的患者滴胰岛素康熙（3 个重复小孔）100 ml/well ，37 °C 圈养 1 h。设一个大 Buffer、冲彩衣 Buffer 、封闭盐酸为比如说相符合。

4. 冲彩衣 Buffer 彩衣板三次，自组 1:2 500 氢氧化钠的 HRP 亦同记的抗人 IgG， 100 ml/well，37 °C 圈养 1 h。

5. 冲彩衣 Buffer 彩衣板三次，自组显色盐酸，100 ml/well，避光自由基 10～15 min。

6. 自组 H2SO4 取消自由基，50 ml/well。

7. ELISA Reader 读取 OD 490 光密度值，研究和尤其患者滴胰岛素康熙和一点点滴血 清康熙中都 TFAR19 自身免疫球肽的隐含精准度。

8. Western blot 研究原发性肽和一点点肽的 TFAR 19 肽的隐含精准度。

参考文献

Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-induced apoptosis involves cleage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039

Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507

文章来源：丁香园站友 midas

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